DNA結(jié)臺蛋白的分離及克隆

【資料簡介】

1. 蛋白質(zhì)純化法和序列分析法

克隆DNA結(jié)合蛋白，蛋白質(zhì)純化法，在得到氨基酸序列后，設(shè)計PCR簡并引物，用于擴增基因片段，zui后通過cDNA文庫篩選得到全長cDNA。該方法在共價交聯(lián)有目的DNA序列的寡核苷酸多聯(lián)體的柱層析樹脂中進行。這種技術(shù)稱為序列特異性DNA親和層析。DNA親和層析方法與常規(guī)的層析方法相似，但往往使用大量的蛋白質(zhì)使層析柱超載，這樣可以增加DNA親和層析的成功率。

蛋白質(zhì)純化到某種程度后，在銀染的凝膠上會看到一條帶或多條帶，因此需要進一步確定哪些條帶的蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合活性相對應(yīng)，可采用變性/復(fù)性、DNA―蛋白質(zhì)印跡法及交聯(lián)法進行確定。相對而言，變性/復(fù)性技術(shù)能夠提供更多的信息。首先通過SDS―PAGE分離DNA親和純化樣品中的蛋白質(zhì)。電泳后，用刀片將凝膠上相關(guān)泳道切成多個凝膠塊。每個凝膠塊中的蛋白質(zhì)通過在合適的緩沖液中浸泡，進行變性，并從聚丙烯酰胺中洗脫。洗脫后通過變性液逐級稀釋成非變性緩沖液，使蛋白質(zhì)復(fù)性，或者在非變性緩沖液中透析。然后，利用EMSA和DNase I足跡法分析每一個樣品，確定特異性DNA―蛋白質(zhì)結(jié)合活性的存在。

2.  氨基酸序列分析及基因克隆

對于已經(jīng)確定具有DNA特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)可以通過測序獲得蛋白質(zhì)的部分肽段序列，也可以利用純化的蛋白質(zhì)制備抗體，篩選表達文庫。肽段測序法更為常用，具體過程是：將蛋白質(zhì)通過化學(xué)法或酶切法切成小肽段，通過質(zhì)譜進行測序，然后通過數(shù)據(jù)庫檢索進行分析，確定它們是否與已知蛋白質(zhì)或表達序列標簽相對應(yīng)。如果相對應(yīng)，其基因或基因片段可以通過合適的途徑得到或通過RT―PCR進行分離。可以利用簡并引物，通過多種PCR方法分離基因片段。PCR產(chǎn)物可以直接測序，也可以克隆進常規(guī)載體后進行測序。

為了確認克隆得到的基因編碼目的蛋白質(zhì)，可通過兩種方法進行驗證：①制備重組蛋白質(zhì)，將該重組蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合特征和zui初抽提物的DNA結(jié)合特征相比較，可以用EMSA方法檢測遷移率是否一致，或者用DNase I足跡法觀察保護模式是否相同。②制備抗重組蛋白質(zhì)或人工合成抗體的多肽，分析它們是否和抽提物及純化蛋白質(zhì)相互作用。抗體能夠超變動或破壞利用抽提物觀察到的EMSA復(fù)合體。

對于與DNA相互作用的蛋白質(zhì)的克隆，也可以通過其他的方法進行，如酵母單雜交等。