人巨細胞病毒 （HCMV）核酸擴增檢測試劑盒說明書
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【名稱】
通 用 名：人巨細胞病毒 （HCMV）核酸擴增檢測試劑盒說明書
英 文 名：Human Cytomegalovirus Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction （PCR）Diagnostic kit
漢語拼音：ren ju xi bao bing du （HCMV）he suan kuo zeng jian ce shi ji he
【目的】本試劑盒適用于檢測血液（全血或血清）、尿液、乳汁等樣本中人巨細胞病毒 （HCMV）DNA，用于人巨細胞病毒 （HCMV）感染的輔助診斷及其感染病人藥物治療的療效監控。其檢測結果僅供臨床參考。
【原理】本試劑盒選取一對人巨細胞病毒（HCMV）特異性引物和一條特異性熒光探針，應用堿裂解法提取DNA，后者在耐熱DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer（內含Mg2+、Tris-HCl等）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR-熒光探針體外擴增法對人巨細胞病毒（HCMV）一段高保守區域進行擴增，從而達到快速實時定量檢測之目的。
【組成】
名 稱 | 數量 | 規格 |
核酸提取液A | 2管 | 2000μl/管 |
核酸提取液B | 4管 | 500μl/管 |
Taq 酶系 | 1管 | 80μl/管 |
HCMV–PCR MIX | 1管 | 960μl/管 |
HCMV陽性質控品 | 1管 | 50μl/管（1×10P7PCopies/ml） |
陰性質控品 | 1管 | 500μl/管 |
備注：10×RCLB等另行配備。
【標本采集】
1. 適用標本：血液（全血或血清）、尿液、乳汁等。
2. 標本采集：
血清：*抽取待檢者靜脈血2ml，置于干燥管中，充分混勻，密閉送檢。
全血：*抽取待檢者靜脈血2ml，置于*抗凝管中，充分混勻，密閉送檢。
尿液：取晨尿10-50ml置于無菌50ml離心管中，3,000g離心5min，棄上清，沉淀加1ml生理鹽水，混勻后轉至一潔凈的1.5ml離心管中，密閉送檢。
乳汁：取乳汁5-10ml置于無菌玻璃管中，密閉送檢。
【適用儀器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、ABI PRISM 7300、LightCycler等毛細管的儀器，MJ Opticon系列或取得資格認證的定量PCR儀。
【保存和運輸】 標本可立即用于測試，也可保存于-20℃待測，保存期為6個月。
【使用方法】
1． DNA提取
1.1全血：按下述步驟操作，用戶也可用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。
1.1.1將抗凝血搖勻，取500μl轉至一潔凈的1.5ml 離心管中，編號標記。
1.1.2 加入1ml 1×紅細胞裂解液（RCLB,試劑盒配備10×RCLB，使用前請用雙蒸餾水按1：9比例配制成1×RCLB），劇烈震蕩30s，3000g離心5min，棄上清。
1.1.3 重復 1.1.2 兩至三次至無明顯紅色沉淀。（若沉淀明顯，請再重復步驟1.1.2 一次）。
1.1.4 加入1ml生理鹽水，劇烈震蕩15s，13,000g離心1min，棄上清。
1.2 血清、尿液、乳汁：處理前請充分混勻，取標本100μl，加入100μl等量核酸提取液A，充分混勻，13,000rpm離心3分鐘，棄上清（勿碰及下面沉淀），沉淀加50μl核酸提取液B，100℃處理10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應。
陰性質控品：取50μl陰性質控品，加50μl核酸提取液B充分混勻（提取液用前需室溫溶解并充分混勻）后100℃10分鐘，13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應。
HCMV陽性質控品：直接取4μl進行PCR擴增，或按照PCR擴增介紹方法進行定量分析。
2．PCR擴增
從試劑盒中取出HCMV-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
設所需要的PCR反應管管數為N（N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：
試劑 | HCMV-PCR MIX | Taq酶系 |
用量 | 24μl | 2μl |
計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品或HCMV-陽性定量標準品（使用前用陰性質控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml）和陰性質控品4μl，10,000rpm瞬時離心30秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性質控品，陽性定量標準品以及未知標本，并設置反應體積（30μl）、樣品名稱、標記熒光基團種類（報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA）和循環條件:
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 （需要剪掉反應蓋），ABI PRISM7300/7500（使用8聯管），MJ Opticon（使用8聯管）等使用薄壁管的儀器，循環條件：94℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40個循環。
LightCycler等使用毛細管的儀器，循環條件：94℃→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個循環。
3．結果分析判定
反應結束后保存檢測數據文件。根據分析后圖像調節baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的標準曲線達到*（correlation數值介于-0.97~-1之間，correlation數值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下記錄儀器自動分析計算出的未知標本數值（Qty-Copies/ml）。
【質控標準】
陰性質控品：全部陰性。沒有熒光值增長。
HCMV-陽性質控品：陽性質控品的 Ct 值均應小于 35.0。
∣r∣≥0.97（correlation數值介于-0.97~-1之間，correlation數值等同于∣r∣值）。
以上條件應同時滿足 ，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。
【結果判定】
測定結果的計算：
如果Ct值﹤38，則實驗樣品的HCMV- DNA含量（基因拷貝數/ml）= Qty-Copies/ml；
如果38﹤Ct值﹤40,為灰區建議重新檢測，重新檢測若38﹤Ct值﹤40判為陽性，否則為陰性。
如果Ct值=40，則HCMV-DNA含量（基因拷貝數/ml）﹤1×10P2PCopies/ml （低于檢測下限）。
【注意事項】
使用前請仔細閱讀說明書。并且嚴格按照說明書進行操作。
試劑盒內各種組分使用前應充分融化混勻并經高速短暫離心后試用。每盒試劑請于3 次內使用完畢。
試劑盒須避光保存，以免熒光物質衰減。所有使用的離心管、 Tip 頭應高壓滅菌，而且必須不含 DNase。
PCR操作應嚴格按照要求分區（試劑配制區、標本處理區、PCR擴增區等），防止實驗室污染。
試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
【公司名稱】 廣州健侖生物科技有限公司
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